Lactobacillus rhamnosus GG (для краткости LGG) - это суперзвезда среди пробиотиков. Эту бактерию добавляют в йогурты, используют в БАДах и изучают в тысячах научных работ. Она помогает пищеварению, укрепляет иммунитет и защищает кишечник от патогенов.

Но есть проблема: живые бактерии капризны. Они погибают от высоких температур, высыхания, окисления. Чтобы LGG могла храниться месяцами и путешествовать по всему миру, её нужно правильно законсервировать. И здесь начинается самое интересное.

Исследователи проверили разные способы заморозки LGG. Варианты были от обычного морозильника (минус 40°C) до жидкого азота (минус 196°C). Результаты удивили даже учёных.

Главное открытие: самая быстрая заморозка в жидком азоте дала лучшие результаты. Выживаемость бактерий составила более 90%! Для сравнения, при медленной заморозке в обычном морозильнике выживало менее 7% клеток.

Почему такая разница? Всё дело в кристаллах льда. Представьте, что происходит внутри бактериальной клетки при замораживании. При медленной заморозке образуются крупные ледяные кристаллы, которые буквально разрывают клеточные мембраны. Это как если бы внутри воздушного шарика медленно вырастали острые ледяные иглы.
Быстрая заморозка создаёт множество мелких кристаллов. Они тоже наносят повреждения, но гораздо меньше. Клетка успевает превратиться в застывший стеклянный шарик, где все процессы просто останавливаются.

Есть ещё один коварный механизм. При медленном замораживании вода из клеток успевает выйти наружу, где замерзает. Внутри клетки концентрация солей растёт, осмотический баланс нарушается. Клетка фактически погибает от обезвоживания и осмотического шока, хотя вокруг неё сплошной лёд.

Время оказалось критичным фактором. Чем дольше бактерии находятся в замороженном состоянии, тем больше погибает. После 2 часов в морозильнике при минус 40°C выживало 62% LGG. Звучит неплохо, правда? Но посмотрите, что произошло после 48 часов: жалкие 6,6%.

Интересно, что жидкий азот справился лучше всех даже при длительной заморозке. После 48 часов при минус 196°C выживало около 71% бактерий. Это почти в 10 раз больше, чем при минус 40°C!

А теперь самый неожиданный поворот в этой истории. Обычно считается, что фосфатно-солевой буфер (PBS) - это хорошая среда для работы с бактериями. Его упоминают в каждом учебнике микробиологии. Он поддерживает pH и должен защищать клетки.

Но исследование показало прямо противоположное. Когда LGG замораживали в PBS, выживаемость была в несколько раз ниже, чем при заморозке в обычной воде! После лиофилизации (об этом чуть позже) с PBS выживало около 2% бактерий, а с водой около 12%.
В чём подвох? Соли в PBS ускоряют образование внеклеточного льда и усиливают осмотический стресс. Получается парадокс: вещество, которое должно помогать, на самом деле вредит.

Это важный урок для всех, кто работает с микробиологией. Интуитивно правильные решения не всегда работают в реальности. Нужны эксперименты и данные, а не слепое следование традициям.

Замораживание только первый этап. Чтобы получить стабильный порошок пробиотика, который можно хранить при комнатной температуре, бактерии нужно высушить. Для этого используется лиофилизация, или сублимационная сушка.

Процесс выглядит элегантно: замороженные бактерии помещают в вакуум, где лёд превращается сразу в пар, минуя жидкую фазу. Получается сухой порошок. Никакого нагрева, никакого кипячения. Физика в чистом виде.

Звучит безопасно? На практике это самый травматичный этап для бактерий. После лиофилизации выживаемость LGG падала катастрофически. Даже в лучших условиях выживало не более 13% клеток.

Почему высыхание так опасно? Всё дело в клеточной мембране. Она состоит из фосфолипидов, окружённых молекулами воды. Вода поддерживает мембрану в гибком, жидкокристаллическом состоянии. Словно смазка в подшипнике: всё работает гладко и бесшумно.

Когда воду удаляют, мембрана переходит в гелевую фазу. Она становится жёсткой, теряет эластичность и начинает протекать. Содержимое клетки вытекает наружу. Клетка умирает, но не сразу, а медленно истекает, теряя свои внутренности.

К счастью, природа предусмотрела защитные механизмы, а учёные научились их использовать. Добавление криопротекторов резко повышает выживаемость бактерий.

В исследовании использовали два вещества: трегалозу (особый сахар) и сухое обезжиренное молоко. Результат впечатлил. С этими добавками выживаемость после лиофилизации выросла до 15,17%. Это может показаться скромным достижением, но на фоне 2% без защиты это прорыв.

Как работают криопротекторы? У них два изящных механизма действия.

Первый механизм можно назвать "заменой воды". Трегалоза это сахар с особой структурой. Его молекулы могут встраиваться в мембрану вместо молекул воды, образуя водородные связи с фосфолипидами. Получается молекулярная подмена: вместо воды в мембране теперь сахар, но мембрана остаётся стабильной.

Второй механизм ещё интереснее. Трегалоза и белки молока при высыхании образуют густую, вязкую массу со свойствами стекла. Бактерии оказываются заключёнными в этой матрице, как насекомые в янтаре. Все процессы в клетках замедляются до почти нуля. Разрушительные реакции не идут, ферменты не работают. Клетка входит в состояние анабиоза.

На электронных микрофотографиях видно, как клетки LGG буквально окружены молочной матрицей. Некоторые клетки всё равно повреждены (видны трещины на поверхности), но большинство надёжно защищено своей стеклянной капсулой.

Может быть, высушенные бактерии хотя бы хорошо хранятся? К сожалению, и здесь новости оказались невесёлыми.

Исследователи наблюдали за лиофилизированным LGG в течение 9 недель. Бактерии хранили при комнатной температуре и при 4°C в обычном холодильнике. Результат оказался печальным: через 9 недель выживало всего около 0,08% при комнатной температуре и 0,45% в холодильнике.

Даже криопротекторы не смогли предотвратить эту медленную гибель. Почему это происходит? Причин несколько. Окисление липидов мембран кислородом воздуха. Денатурация белков. Накопление повреждений ДНК от фонового радиоактивного излучения.

Даже в высушенном состоянии, даже в "стеклянной" матрице медленные химические реакции продолжаются. Время неумолимо, и рано или поздно накопленные повреждения убивают клетку.

Все эти данные критически важны для нашей работы в Трансбиом. Фекальная трансплантация требует сохранения не одного вида бактерий, а целого микробного сообщества. Сотни видов с разными свойствами, разными мембранами, разной устойчивостью к стрессам.

Исследование на LGG показывает, что универсального протокола не существует. Каждый штамм бактерий может требовать своих условий. То, что работает для одного вида, может убить другой. Это как пытаться создать зоопарк, где белым медведям и крокодилам одинаково комфортно.

Вот что мы узнали и что берем к применению на практике:

Это исследование открывает больше вопросов, чем даёт ответов. Что происходит с разнообразием микробиома при заморозке? Выживают ли все виды бактерий одинаково, или некоторые виды исчезают, нарушая баланс сообщества?

Как криопротекторы влияют на разные бактериальные штаммы? Может быть, трегалоза хороша для одних бактерий, но вредна для других? Существуют ли "универсальные" защитные смеси?

Можно ли предсказать, какие бактерии выживут, а какие погибнут, ещё до заморозки? Есть ли генетические маркеры устойчивости к криоконсервации?

Мы в Трансбиом работаем над этими вопросами. Наша цель: разработать протоколы, которые сохранят максимальное разнообразие и функциональность донорской микробиоты. Это критически важно для успеха фекальной трансплантации.